Pyrosequencing

Ein 1996 in Schweden entwickeltes Verfahren zum Nachweis bekannter Mutationen oder SNPs, von Methylierungsmustern und unbekannter kurzer DNA-Abschnitte ist das Pyrosequencing. Es beruht auf dem Prinzip „sequencing by synthesis“ und ist verglichen mit der Sequenzierung nach Sanger deutlich sensitiver. Im Gegensatz zur Sequenzierung nach Sanger beruht die Reaktion nicht auf der Detektion von Fluoreszenzsignalen von eingebauten Stopp-Nukleotiden, sondern auf einer messbaren Lichtemission, wenn das jeweils passende Nukleotid bei der Strangelongation in die DNA eingebaut wird. Nach Amplifikation des zu untersuchenden Genabschnitts mittels PCR werden in der Sequenzierungsreaktion die Nukleotide daher einzeln und nacheinander in immer wiederkehrender Abfolge der Reaktion zugegeben. Das jeweils passende Nukleotid, welches bei der Strangelongation in die DNA eingebaut wird, führt zur Freisetzung von Pyrophosphat (PPi), wodurch unter Beteiligung von Luciferase ein Lichtsignal freigesetzt wird. Das Lichtsignal wird von einer CCD-Kamera detektiert und als Peak in der Auswerte-Software sichtbar. Dabei ist die Peak-Höhe proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. Nach Ablauf jeder Einzelreaktion werden nicht eingebaute Nukleotide degradiert, wodurch das Lichtsignal erlischt und der Reaktionsablauf mit der Zugabe des nächsten Nukleotids von neuem beginnt. Mit Ablauf dieses Prozesses kann die Sequenz anhand der Signal-Peaks im Pyrogramm bestimmt werden. So können viele Proben in relativ kurzer Zeit bearbeitet werden. Eine Optimierung der Pyrosequencing-Technologie stellt Next Generation Sequencing mit der 454-Technologie von Roche Diagnostics GmbH dar, die Ultra Hochdurchsatz Analysen erlaubt.